Badania

5-podstawione pochodne uracylu jako potencjalne radiosensybilizatory.

Aby dokonać wstępnej selekcji potencjalnych sensybilizatorów opracowaliśmy prosty i tani protokół, opierający się o obliczenia kwantowochemiczne (typu DFT) analizujące zachowanie MN podczas przyłączenia elektronu (ChemPhysChem, 2016, 17, 1-8).  Otrzymanie reaktywnego rodnika zlokalizowanego na zasadzie nukleinowej (lub na fragmencie podstawnika) w modelowanej kwantowochemicznie reakcji DEA stanowiło przesłankę do podjęcia dalszych badań nad właściwościami sensybilizującymi badanej molekuły (Rysunek 1). Proponowany protokół selekcji MN pozwolił z jednej strony odrzucić kilkadziesiąt pochodnych uracylu, tworzących pod wpływem przyłączenia elektronu anionorodniki niezdolne do DEA, bez konieczności kosztownej syntezy i analizy tych pochodnych. Co więcej, zaowocował propozycją kilku obiecujących związków takich jak: SeCNdU, OTfdU, BrSdU, ISdU, CF3CONHU, SU, DMSU czy 6IdU.


Rysunek 1. Modelowanie procesu DEA prowadzącego do pożądanych uszkodzeń DNA indukowanych przyłączeniem nadmiarowego elektronu. 
Modelowanie uszkodzeń w dwuniciowym DNA znakowanym sensybilizującymi MN.

Uzyskanie reaktywnego rodnika wewnątrz nici DNA na skutek degradacji potencjalnego radiosensybilizatora, jest uważane za kluczowe dla zainicjowania szeregu reakcji rodnikowych, prowadzących do trwałego uszkodzenia biopolimeru. Przy pomocy metadynamiki QM/MM kompleksowo przeanalizowaliśmy możliwe ścieżki degradacji rodnika powstającego z MN (J. Chem. Theory Comput. 2017, 13, 6415–6423). Zastosowana metodologia pozwoliła uwzględnić środowisko podwójnej nici DNA i po raz pierwszy w tak pełny sposób opisać termodynamikę i kinetykę mechanizmów obserwowanych eksperymentalnie ścieżek degradacji pochodnych puryn: β-eliminacji (odpowiedzialnej za powstawanie pęknięć nici) oraz cyklizacji (Rysunek 2).

Rysunek 2. Ścieżki degradacji rodnika 8-adenozylowego w DNA.
Stacjonarna i impulsowa radioliza wodnych roztworów zawierających  potencjalne radiosensybilizatory.

Jednym z warunków koniecznych, które musi spełnić MN aby stać się radiosensybilizatorem, jest degradacja indukowana przyłączeniem elektronu. Przeprowadzone eksperymenty radiolizy stacjonarnej odtlenionych, wodnych roztworów badanych pochodnych w obecności buforu fosforanowego oraz tert-BuOH (zmiatacza rodników •OH) pozwoliły na wstępną weryfikację właściwości radiosensybilizujących poszczególnych pochodnych (Rysunek 3). W przypadku pochodnych SeCNdU, OTfdU (RSC Adv., 2018, 8, 21378−21388), ISdU (IJMS, 2019, 20, 1308), BrSdU (Molecules, 2019, 24, 2819) oraz CF3CONHU (IJMS, 2020, 21, 6352) zidentyfikowano produkty degradacji, a ich struktury określono z wykorzystaniem techniki LC-MS/MS. Zaproponowane zostały również mechanizmy tworzenia radioproduktów, które zostały potwierdzone w eksperymentach radiolizy impulsowej (Molecules, 2019, 24, 2819).  

Rysunek 3. Analiza HPLC roztworu  BrdU (A), CH2CNU (B), SeCNdU (C) i OTfdU (D) przed (linia czarna)  i po napromienieniu dawką 140 Gy.
Badania komórkowe obiecujących układów.

Pochodne, które pozytywnie przeszły wstępną weryfikację właściwości radiosensybilizujących poddano testom na poziomie komórkowym. Przeprowadzone zostały  testy MTT/ WST-1 określające cytotoksyczność względem komórek zdrowych (HDFa), jak i nowotworowych (MCF-7 i PC3). Właściwości radiosensybilizujące MN względem komórek nowotworowych potwierdzono w oparciu o test klonogeniczności.

Rysunek 4. Krzywa odpowiedzi względem dawki promieniowania – przeżywalność komórek MCF-7 traktowanych/ nietraktowanych CF3CONHU (100 µM).

W przypadku komórek traktowanych pochodnymi ISdU (IJMS, 2019, 20, 1308) oraz CF3CONHU (IJMS, 2020, 21, 6352) (Rysunek 4) zaobserwowano obniżenie ich przeżywalności. W przypadku BrSdU (Molecules, 2019, 24, 2819) nie obserwowano różnic pomiędzy komórkami traktowanymi bądź też nie badaną pochodną. Fakt ten potwierdza kluczową rolę procesu DEA w radiosensybilizacji. W przypadku ISdU i BrSdU wykonano dodatkowe testy komórkowe. Analiza cytometryczna markera podwójnych pęknięć DNA – histonu H2AX – wskazuje, że traktowanie komórek ISdU (IJMS, 2019, 20, 1308) powoduje zwiększenie puli komórek pozytywnych względem γH2AX (Rysunek 5), co potwierdza, że  za zwiększoną wrażliwość komórek na promieniowanie jonizujące (PJ) odpowiadają podwójne pęknięcia nici DNA.

Rysunek 5. Analiza cytometryczna fosforylacji histonu H2A.X dla ISdU.

W kolejnym projekcie zbadano wpływ hipoksji na właściwości radiosensybilizujące BrdU. Okazało się, że podczas gdy stężenie tlenu nie wpływa istotnie na wydajność inkorporacji nukleozydu do genomowego DNA i proliferację komórek nowotworowych z linii MCF-7 i PC3 (Rysunki 6A i 6B), efekt radiosensybilizujący wyraźnie zależy od stopnia ich natlenienia (Rysunek 6C). Dalsze badania nad mechanizmem radiosensybilizacji na poziomie komórkowym pokazały, że indukowane PJ tworzenie dwuniciowych pęknięć DNA (których markerem molekularnym jest fosforylacja histonu H2A.X) jest zdecydowanie bardziej wydajne w warunkach hipoksji niż w przypadku normalnego stężenia tlenu (Rysunek 6D). Dodatkowo, za pomocą techniki Western blot zanalizowano główne punkty kontrolne odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia DNA indukowane PJ. Praca pt. “ Influence of hypoxia on radiosensitization of cancer cells by 5-bromo-2’-deoxyuridine” jest w trakcie publikowania.

Rysunek 6. Proliferacja komórek MCF-7 traktowanych BrdU (0-100µM) w warunkach hipoksji i normoksji (A, B). Efekt radiosensybilizujący (test klonogeniczności) BrdU wobec komórek PC3 w warunkach hipoksji i normoksji (C). Porównanie poziomu fosforylacji histonu H2A.X (wydajność tworzenia pęknięć dwuniciowych) dla komórek PC3 w warunkach hipoksji i normoksji (D).
Synteza enzymatyczna znakowanego DNA.

Z poszukiwaniem efektywnego sensybilizatora związane są nieodłącznie badania z wykorzystaniem znakowanych sekwencji DNA. Jednak możliwość syntezy takich układów jest poważnie ograniczone z względu na dostępność odpowiednich trifosforanów/amidofosforanów. W ramach realizacji niniejszego projektu przeprowadzono chemiczną syntezę 5-jodo-4-tio-2’-deoksyurydyno-5’-trifosforanu (ISdUTP) oraz enzymatyczną syntezę modelowego, dwuniciowego fragmentu DNA o długości 30 pz, znakowanego ISdU (Rysunek 7B).

Rysunek 7. Synteza enzymatyczna fragmentu DNA o długości 30pz, znakowanego punktowo sensybilizatorem. Analiza DHPLC mieszaniny oligonukleotydów przed reakcją (A), po reakcji z ISdUTP (B) i BrdGTP (C).

Synteza enzymatyczna polegała kolejno na hybrydyzacji trzech komplementarnych oligonukleotydów (ss14, ss15p i ss30), włączeniu ISdUTP przez izotermiczną polimerazę (fragment Klenowa exo-), połączeniu powstałych końców przez ligazę T4 (Rysunek 8). Podobne podejście zastosowano w przypadku syntezy fragmentu DNA znakowanego BrdG (Rysunek 7C). W tym przypadku jednak niezbędna jest optymalizacja etapu ligacji. Zoptymalizowane protokoły syntezy umożliwią przeprowadzenie kolejnych eksperymentów, mających na celu zbadanie szczegółów mechanistycznych procesu zarówno foto- jak i radiosensybilizacji i wskazanie rodzaju powstałych uszkodzeń DNA. Praca pt. “Chemically–enzymatic synthesis and photosensitivity of DNA labeled with 5-iodo-4-thio-2’-deoxyuridine” jest w trakcie publikowania.

Rysunek 8. Idea chemiczno-enzymatycznej metody syntezy DNA znakowanego ISdU.
Mechanizm fotoindukowanego uszkadzania znakowanego  DNA.

Właściwości fotouczulające BrdU badano od lat 60. ubiegłego wieku, a mechanizm sensybilizacji wywoływanej obecnością tej halogenopochodnej uracylu w DNA przypisywano dalekozasięgowemu transferowi elektronu (ET) wywołanemu wzbudzeniem elektronowym BrdU światłem z zakresu UVB (λmax~280 nm). Badania zrealizowane w ramach niniejszego projektu potwierdziły mechanizm uszkadzania oparty o ET. Otóż zbadaliśmy wydajność fotochemicznego tworzenia jednoniciowego pęknięcia DNA (SSB) w syntetycznych dwuniciowych sekwencjach oligonukleotydowych, 5’-XGGABrdUY, znakowanych BrdU i różniących się zasadami X,Y sąsiadującymi odpowiednio od strony 3’ z BrdU i od strony 5’ z guaniną. Wydajność powstawania pęknięcia oznaczyliśmy metodą LC/MS, a model matematyczny opisujący zależność wydajności tworzenia SSB od podatności oligonukleotydu na ET, został wyprowadzony w oparciu o teorię Marcusa transferu elektronu:

gdzie η oznacza wydajność tworzenia SSB, ΔGET wielkość bodźca termodynamicznego procesu ET, zaś λ energię reorganizacji. Bodziec termodynamiczny, ΔGET, obliczono jako różnicę powinowactwa elektronowego i energii jonizacji, wyznaczonych kwantowochemicznie, dla każdej pary BrUY:XG.

Fakt odzwierciedlania przez tak zdefiniowany model rozkładu punktów doświadczanych (Rysunek 9) potwierdza fotoindukowany transfer elektronu jako pierwotną przyczynę tworzenia się SSB w badanych układach (J. Phys. Chem. B, 2017, 121, 9169−9174).

Rysunek 9. Wydajność tworzenia SSB w funkcji obliczonej energii swobodnej procesu ET. Linia ciągła uzyskana drogą dopasowania do modelu teoretycznego.

Podobnie, nasze badania wyjaśniające znacznie wyższą wydajność fotoindukowanego tworzenia SSB w sekwencji 5’-ABrU w porównaniu do 5’-GBrU w dwuniciowym DNA sugerują mechanizm uszkadzania przebiegający poprzez fotoindukowany ET z odległej guaniny (Phys. Chem. Chem. Phys., 2019, 21, 4387−4393). Rzeczywiście, wartości sprzężenia elektronowego wyznaczone metodą FCD (i uśrednione dla 3000 konfiguracji wyekstrahowanych z trajektorii MD dla dwuniciowego oligonukleotydu o sekwencji 5’-GCG CTA TCG XBrUT ATC GCG, gdzie X = A lub G), energii reorganizacji i siły napędowej procesu (Rysunek 10), pokazują że ze względu na stosunkowo wysoką energię reorganizacji stałe szybkości procesu ET są zbyt małe, aby prowadzić do wydajnego fotouszkadzania DNA. Dopiero wprowadzenie mostka (A)n pomiędzy donorem elektronu (G) a BrU prowadzi (dzięki delokalizacji elektronu) do zmniejszenie energii reorganizacji i odpowiedniego wzrostu stałej szybkości przeniesienia elektronu, co umożliwia postęp reakcji fotochemicznego tworzenia SSB. Nasze wyniki doskonale tłumaczą znaczną wydajność fotouszkodzeń w sekwencji 5’-GAABrU i praktyczny ich brak w 5’-AAGBrU.

Rysunek 10. Krzywe diabatyczne (linie kropkowane) i adiabatyczne (linie ciągłe)  dla procesów rozdzielania (CS) i rekombinacji ładunku (CR). Zaznaczono energię reorganizacji (λ), siłę napędową (∆E) i element macierzowy sprzężenia elektronowego  (VDA) dla CS i CR.

Opisane wyżej badania fotochemiczne doprowadziły też do zupełnie nieoczekiwanej obserwacji. Mianowicie, w niektórych eksperymentach fotochemicznych obserwowaliśmy brak pęknięć biopolimeru, a zamiast nich rejestrowaliśmy fotodebromowanie BrdU. Przykład takiego eksperymentu obrazuje Rysunek 11 (J. Pharm. Biomed. Anal., 2017, 142, 262–269). Chromatogram 11A pokazuje fotochemiczne tworzenia się oligonukleotydu zawierającego 2’-deoksyurydynę zamiast BrdU. Natomiast chromatogram 11B uwidacznia powstawanie pęknięcia w tej samej sekwencji (fragmenty ss26 i ss48). Różnica pomiędzy naświetlanymi układami sprowadza się do różnego sposobu przygotowania oligonukleotydów. Fragment DNA użyty w eksperymencie (11A) pochodzi bezpośrednio od producenta, zaś użyty w eksperymencie (11B) był wielokrotnie liofilizowany przed rozpuszczeniem w odpowiednim buforze. Efekt ten wytłumaczyliśmy zanieczyszczeniem komercyjnych oligonukleotydów trietyloaminą (TEA; do oczyszczania syntetycznych oligonukleotydów wykorzystuje się chromatografię IP-RP-HPLC, gdzie jako   czynnik umożliwiający tworzenie par jonowych stosuje się octan trietyloaminy). Rzeczywiście, TEA jest znanym donorem elektronów prowadzącym do efektywnego tworzenia par jonowych w reakcjach fotochemicznych (np. wzbudzanie cykloheksanonu w obecności TEA). Ta reakcja przeniesienia ładunku jest prawdopodobnie odpowiedzialna za całkowite gaszenie dalekozasięgowego ET wewnątrz DNA, który w obecności TEA jest zastępowany bezpośrednim przeniesieniem elektronu z trietyloaminy na BrdU, prowadząc do tworzenia dU. Wykorzystując spektrometrię mas wykazaliśmy, że w zależności od producenta (badano materiał pochodzący do 4 producentów) ilość trietyloaminy przekracza nawet 1000-krotnie ilość oligonukleotydu w zamawianym materiale.      

Rysunek 11. Fotochemiczne debromowanie BrdU w dsDNA (oligonukleotyd bezpośrednio od producenta (A). Fotochemiczne powstawanie SSB w liofilizowanej sekwencji (B).
Enzymatyczna fosforylacja MN – warunek konieczny działania sensybilizatora.

Aby efektywnie działać, nukleozydy muszą wcielać się do DNA w trakcie jego replikacji lub naprawy. Jednym z podstawowych warunków umożliwiających inkorporację do DNA jest dopasowanie nukleozydu do specyficzności substratowej hTK1, enzymu katalizującego przekształcanie nukleozydów w ich 5’-monofosforany. W pracy Struct. Chem. 2018, 29, 1367–1374, opublikowaliśmy model chemometryczny, przewidujący aktywność hTK1 wobec nukleozydów (Rysunek 12). Do konstrukcji modelu wykorzystaliśmy aktywność enzymatyczną hTK1, wyznaczoną eksperymentalnie dla 26 analogów urydyny. Uzyskaliśmy wiarygodny model QSAR wymagający jedynie trzech deskryptorów molekularnych. Dwa z nich odnoszą się do kształtu molekuły, trzeci zaś jest związany z jej podatnością na oddziaływania z enzymem. Przeprowadzane badania sugerują również, że najłatwiej powinny ulegać fosforylacji analogi urydyny podstawione w pozycji 5.

Rysunek 12. Porównanie obliczonych i mierzonych wartości aktywności hTK1.

Aktywność kinazy hTK1 wobec modyfikowanych nukleozydów o właściwościach sensybilizujących wyznaczona została również eksperymentalnie. Badania kinetyczne polegały na monitorowaniu powstającego ADP metodą spektrofluorymetryczną. Na Rysunku 13 przedstawiono aktywności kinazy w stosunku do badanych nukleozydów. Istotne obniżenie aktywności zaobserwowano w przypadku pochodnej OTfdU, natomiast SeCNdU w ogóle nie ulega fosforylacji w badanym układzie. Uzyskane wyniki mogą sugerować, że wewnątrzkomórkowa fosforylacja jest „wąskim gardłem” procesu inkorporacji tych analogów do genomowego DNA.

Rysunek 13. Aktywność ludzkiej kinazy hTK1 względem analogów nukleozydów.

Efektywność działania hTK1 powinna korelować z energią wiązania nukleozydu w centrum aktywnym. Różnice w powinowactwie kinazy tymidynowej hTK1 do zmodyfikowanych nukleozydów względem jej natywnego substratu (2’-deoksytymidyna, dT) zostały oszacowane przy zastosowaniu „alchemicznego” wariantu dynamiki molekularnej, w którym dT jest stopniowo przekształcana w badany ligand zarówno w centrum aktywnym enzymu, jak i w roztworze, a towarzyszące tym przekształceniom zmiany energii swobodnej wyznaczane są w oparciu o metodę całkowania termodynamicznego. Odjęcie od siebie wspomnianych wyżej zmian energii swobodnej umożliwia, przy wykorzystaniu odpowiedniego cyklu termodynamicznego, obliczenie wartości ΔΔG oddziaływania względem oddziaływania z dT, charakteryzujących zdolność ligandów do wiązania się z hTK1 (wartości ΔΔG dla badanych nukleozydów: BrdU, SCNdU, OCNdU, SeCNdU i OTfdU wynoszą odpowiednio -1,76, +1,79, -3,03, +2.44 i +0.52 kcal/mol). Dodatkowym efektem przeprowadzonych symulacji było uzyskanie zrównoważonych struktur zmodyfikowanych nukleozydów w centrum aktywnym hTK1 (Rysunek 14).  

Rysunek 14. Przykładowa struktura kompleksu dimeru hTK1 ze zmodyfikowanym nukleozydem.
Stabilność MN w roztworze wodnym.

Ponieważ woda jest naturalnym środowiskiem dla wszystkich układów biologicznych, modyfikowane nukleozydy muszą być w niej stabilne, żeby efektywnie znakować DNA. Proces hydrolizy wybranych pochodnych uracylu scharakteryzowaliśmy metodą DFT, która posłużyła do wyznaczenia energii aktywacji i bodźca termodynamicznego dla poszczególnych reakcji elementarnych. Bariera kinetyczna dla reakcji hydrolizy 6-jodourydyny (6IUrd) została również wyznaczona eksperymentalnie poprzez konstrukcję wykresu Arrheniusa i posłużyła do zweryfikowania przyjętego poziomu teorii (CAM-B3LYP/DGDZVP++). Obliczone teoretycznie charakterystyki poszczególnych reakcji posłużyły do konstrukcji układu równań różniczkowych, którego wynik całkowania zaprezentowany jest na Rysunku 15. Uderzające różnice czasów połowicznego zaniku dla badanych pochodnych jasno pokazują, że 6IdU nie może pełnić roli radiosensybilizatora (τ1/2 wynosi jedynie 1,5 sekundy –  Rysunek 15). Dlatego przewidywanie stabilności hydrolitycznej modyfikowanych nukleozydów powinno poprzedzać ich syntezę. Praca na ten temat zostanie wkrótce wysłana do redakcji JPC B.

Rysunek 15. Zmiany stężenia w funkcji czasu dla substratów, produktów i produktów przejściowych  wyznaczone przy pomocy modelu kinetycznego: (a) 5IdU, (b) 6IdU oraz (c) 6IUrd.